一、PCR實驗室的清潔消毒

（1）PCR實驗室應設置試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物和擴增區及擴增產物分析區4個工作區城，4個區域必須是相互獨立的，不能直通，應有緩沖間供工作人員換工作服和鞋，并且有明確的標志，進入各工作區域嚴格按照從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物和擴增區→擴增產物分析區單一方向進行。

（2）各區有完善的相應設備，儀器設備和所有物品必須嚴格分開，不得混用，不同的工作區域使用不同顏色的工作服.工作人員離開時不得將工作服帶出。在整個PCR實驗操作過程中，工作人員都必須戴上手套，并經常更換，還要求工作人員戴口罩，避免在處理樣本時對人體造成污染，保證工作人員的身體安全。每次實驗前應作好吸嘴Eppendorf管、反應管和加樣器等物品的高壓消毒，各工作區域的地面用10%次氯酸鈉消毒，打開排風扇使各區的空氣流通。

（3）試劑貯存和準備區：貯存試劑的制備、試劑分裝和主反應混合液的制備都應在該區完成。貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區，不能經過產物分析區。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。貯存試劑溶液經檢查可用后，應將其分裝貯存備用避免由于經常打開反應管吸液而造成污染。目前本科室使用的試劑盒反應液是廠家配好的，單人單管只需從此區移至下一個工作區域。工作結東后必須立即對工作區域進行清潔消毒，實驗室的桌椅表面每次工作后也要清潔，實驗室的空氣消毒打開房項的紫外燈照射。

（4）標本制備區：標本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的提取方法，選擇好的試劑品牌是一個很關鍵的問題，試劑質量的好壞直接影響到實驗結果的準確性。臨床標本都集中在本區，實驗操作過程中一定要嚴格按照實驗室操作流程，特別在加樣中，空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠污染，所以應避免在本區內不必要的走動，為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管，防止溶液外濺。工作結束后必須立即對實驗臺表面、加樣器、有機玻璃試管架，離心機，首先用10%次氯酸鈉消毒，然后用70%乙醇清潔，另外，實驗臺表面使用254nm波長可移動紫外燈，距離實驗臺上60~90 cm內長時間照射照射過夜更好。用過的吸嘴必須放人專用的含次氯酸鈉溶液的容器內浸泡，實驗室的桌椅表面每次工作后也要清潔，實驗室的空氣消毒同樣打開房頂的紫外燈照射。

（5）擴增區：DNA擴增不能從本區再進人任何“上游”區城，以避免氣溶膠從本區漏出，本區是最主要的擴增產物污染來源，因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。本區工作后的清潔消毒和紫外燈照射方法與前面區域相同。

二、PCR實驗室的防污染措施

（1）污染原因：①擴增產物污染：這是 PCR反應中最主要也是最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以，極微量的PCR產物污染，就可造成假陽性。實驗材料如重組克隆的DNA或者來自同一次PCR的擴增產物污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器，容器及其他溶液被PCR核酸模板污染。②測試樣品污染：收集標本的容器被污染或標本放置時由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于加樣器污染導致標本間污染；尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。③氣溶膠污染：最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較刷烈地搖動反應管開蓋時、吸樣時及污染加樣器的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆粒可含48 000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。另外，實驗室的環境、試劑及任何與擴增產物接觸的東西，都是污染的來源。

（2）防污染措施：PCR 實驗室嚴格分區：將實驗室分為4個工作區域并嚴格按照從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物和擴增區→擴增產物分析區單一方向順序進行。各區必須相互獨立，儀器設備和各種物品嚴格分開，不能串用。分裝PCR試劑：當使用的PCR試劑盒，不是獨立分裝的反應液時，應將PCR反應液預先配制好。然后分裝到反應管-20℃保存，以減少重復加樣次數，避免污染機會。PCR試劑、PCR反應液與樣品及PCR產物分開保存，試劑盒電面的陽性對照、陽性參考品也應該與試劑分開放置，不應放于同一冰箱。正確使用加樣器：吸樣時要特別小心應緩慢勻速，避免液體濺到加樣器頭上，盡量一次性吸完，忌反復多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠。打出液體后拇指不應松開按鈕，將吸嘴壓掉后冉將拇指松開，避免液體回吸。實驗前后按要求作好實驗室的清潔消毒工作，特別是實驗完成后，消毒工作一定要徹底，破壞殘留的DNA防止操作人員污染，使用一次性手套，吸嘴、Eppendorf管和反應管也應該一次性使用。Eppendorf管的質量也不容忽視，好質量的(有齒輪)Eppendorf管，管蓋密封嚴實，避免樣本外溢和外來核酸的進入。打開之前應先離心，將管壁和管蓋上的液體甩至管底開蓋時動作要輕以防管內液體濺出，造成污染。應設陽性對照和陰性對照，選擇拷貝在臨界值的弱陽性作陽性對照，并注意交叉污染的可能性，每次實驗都應有一管不加模板的試劑對照，以監測試劑是否污染，還應帶一個不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

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