醫院是各種病人聚集的地方，也是各種病原微生物滋生的地方，所以，醫院環境的消毒也是一項非常重要的工作。
一般情況下，凡是沒有被傳染病病人接觸過的醫院環境，包括多數設備，只需徹底清洗，無需消毒。但當遭受血液、體液污染或感染性疾病病人接觸過時，需用含有效氯0.5%～1%的消毒劑消毒；另外，營養室、配餐室的桌面、免疫力低下病人或易感病人的環境清潔消毒也可用含氯消毒劑。
用物理、化學以及生物的方法，使室內空氣的含菌量盡量減少到無塵無菌狀態，常采用濕式清掃、定時通風換氣和紫外線空氣消毒等措施。若遇傳染或嚴重感染性疾病病人出院可采用過氧乙酸噴霧或熏蒸進行消毒。近年來，一些手術室、骨髓移植室以及無菌藥物制劑室等室內的空氣，均采用生物凈化法使室內空氣達到絕對凈化。
一般被服均經洗滌后高溫消毒。對特殊感染所污染的被服最理想的滅菌方法是用環氧乙烷氣體素蒸滅菌。各科病人的被服可集中起來，先送環氧乙烷消毒間滅菌后，再送洗衣房清洗備用。
工作人員的手，一般情況下，用肥皂和流水清洗可去除表面一過性的污染菌。但如接觸過被致病菌污染的人或物后，不但要用肥皂和流水沖洗，還要用碘伏或其他滅菌液浸泡消毒。外科手術野和注射部位的皮膚宜先用2%~2.5%碘酊消毒一遍，20秒后再用75%酒精脫碘兩遍的消毒方法或選用碘伏消毒兩追的方法。粘膜的消毒可根據不同的部位選擇不同的消毒劑。
醫療器械以及其他物品是治療和檢查必不可少的用具，直接接觸病人的粘膜、創口等，所以是導致醫院感染的重要途徑，必須進行嚴格的清潔、消毒、滅菌處理。消毒方法以壓力蒸汽滅菌法最為可靠。但對不耐高溫高壓的塑料、玻璃及銳利的手術刀、剪等可用化學消毒劑浸泡消毒滅菌。
凡穿透皮膚、粘膜進入無菌組織的器材，均需嚴格滅菌，并首選壓力蒸汽滅菌；如外科手術器材、心導管、導尿管、針頭等，這類器材被任何致病微生物污染，都有引發嚴重感染的危險。凡接觸病人粘膜及有破損皮膚的器材，如呼吸機近端、麻醉機近端、內窺鏡、口腔器械等，必須進行滅菌和高水平的消毒處理，可選用熱消毒或性能良好的化學消毒劑，如環氧乙烷、2%戊二醛等。
由于完整的皮膚對多數微生物有屏障作用，所以對一些只與完整皮膚接觸的物品，如體溫計、便盆、血壓計袖帶、床頭柜等，不需滅菌處理，只需清洗干凈或選用低效消毒劑浸泡消毒即可。